技術介紹
CRISPR/Cas9 是一種基于細菌天然免疫機制開發(fā)出來的基因編輯技術，用于抵御病毒等外來物入侵的一種防御機制。經改造的CRISPR系統(tǒng)主要由Cas9蛋白和單鏈向導RNA（sgRNA）組成，其中sgRNA對靶序列進行特異性識別，Cas9蛋白負責對識別的靶序列進行切割，從而實現(xiàn)DNA的雙鏈斷裂。DNA雙鏈斷裂后，細胞對DNA的損傷修復機制就會被激活。目前主要有兩種修復機制，非同源末端連接（NHEJ）修復和同源重組介導的修復（HDR）。沒有外源模板時，機體主要進行NHEJ修復。NHEJ修復過程中，會在切割位點隨機的進行缺失或插入堿基序列，導致DNA移碼突變，從而使基因不能正常表達。存在外源模板的情況下，機體會啟動HDR修復來實現(xiàn)基因的精準插入或者替換。
目前，利用CRISPR-Cas9構建基因敲除（KO）細胞系的技術已經越來越成熟，那么KO細胞系的應用有哪些？可以幫助我們解決什么問題呢？
基因功能研究由于模式生物基因組測序系統(tǒng)的逐漸完善，使CRISPR/Cas9技術在基因組中同時進行多靶位點的編輯成為可能。研究表明將缺失突變引入不同基因的編碼外顯子中，可以在人細胞中當做強大的陰性和陽性篩選對照。與先前的 RNAi 技術的脫靶嚴重、編輯效率低及僅限于轉錄過程相比，CRISPR/Cas9技術介導的篩選可更好的實現(xiàn)專一性和敏感性，設計的sgRNA可以靶向任何 DNA 序列。RNAi 方法只導致基因表達抑制，而CRISPR/Cas9技術產生的Indels可以致使基因功能喪失，比RNAi 出現(xiàn)更加明顯的表型，這更容易鑒定目的基因。
藥物靶點的確定利用CRISPR-Cas9技術建立基因缺失病變的KO細胞模型，有助于研究疾病的發(fā)病機制和篩選潛在的藥物靶點，并通過高通量藥物反應數(shù)據，初步篩選出在特定藥物處理下細胞存活率變化顯著的細胞系，進而評估藥物對特定基因敲除細胞的影響，從而篩選出有效的藥物候選物。從基因的功能研究到藥物靶點的篩選，再到藥物效果的評估及驗證，KO細胞系提供了一個強有力的實驗平臺，加速了新藥的研發(fā)進程。同時，KO細胞系不僅在細胞層面上有所應用，還可以用于構建動物模型，進一步研究藥物在體內的作用機制和治療效果，尤其是在遺傳性疾病的治療研究中發(fā)揮著巨大作用。
抗體是生命科學研究中的常用試劑之一，抗體的特異性對研究者們至關重要?？贵w的特異性是指抗體能夠識別并結合到其目標抗原的能力，而不與其他非目標分子發(fā)生交叉反應。特異性抗體可以減少實驗中的誤差，降低了非目標分子的干擾，有助于提高實驗的可重復性，使實驗結果更加可靠。目前，基因敲除驗證（KO）是廣受信任且接受度最為廣泛的抗體特異性驗證方法之一。利用CRISPR-Cas9技術，構建目的基因缺失的KO細胞系。如果抗體是特異性的，那么不應該檢測到信號，而在野生型（WT）細胞系中則應該檢測到特異性靶蛋白的信號。KO細胞系提供了真正意義上的陰性對照，一度被稱為“抗體特異性驗證的金標準"，以確認抗體對目標蛋白的特異性。
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服務內容:
Tip: 請您填寫項目申請表，以便Bioss為您提供更好的技術服務。
服務流程：
1.客戶提供需要敲除的指標信息，與公司商定具體的制備項目、數(shù)量和費用，雙方簽訂《委托CRISPR/Cas9基因敲除服務合同》。
2.雙方確定合作細節(jié)，實驗過程中及時反饋實驗進程，并按照規(guī)定時間完成委托服務。并向客戶提供委托產品與實驗報告。
1.RNP轉染法
2.質粒轉染法
1.兩種敲除方法（質粒法和RNP法）可供客戶選擇。2.每個靶標設計多條sgRNA，提供多種敲除策略，最大限度的提高的KO效率，提高蛋白水平的敲除概率。
3.通過Sanger測序后，多種軟件分析編輯效率，提高編輯結果的準確性。
4.不同的細胞系具有專屬的轉染方案，提高靶標編輯的效率。
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